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多能幹細胞凍存和複蘇方法

干细胞冻存是干细胞扩增传代过程中重要的一环,但是干细胞不同于普通细胞系,其增殖扩增过程中需要聚团生长,为保持其细胞活性,不建议单细胞传代。而且使用血清+DMSO冻存方法,不能很好的保持细胞活性,且複蘇細胞成活率较低。这次就重点介绍干细胞进行冻存以及解冻的标准化步骤。

本方法适用于HAKATA? 人间充质干细胞无血清培养基以及HAKATA? 无血清细胞冻存液培养的细胞(同样适用于mTesR以及E8系统培养的细胞),冻存以及复苏前后,应当使用同一种培养基,复苏传代后可以更换其他培养体系。

HAKATA? 无血清细胞冻存液是一款化学成分确定,无血清,无动物源成分,且无需程序降温的高效冻存液。具体冻存及复苏操作方法如下:

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1、凍存:以下操作方法以6孔板爲例:

注意:如果使用mFreSR?,請將所需量的mFreSR?融化並置于冰上。

(1) HAKATA? 无血清细胞冻存液为即拿即用,且4℃保存,冻存液拿出后应快速放回4℃;

(2)使用幹細胞消化液消化細胞;

(3)收集細胞,室溫300×g離心5分鍾;

(3)小心吸掉上清液,不要幹擾細胞團;

(4)用1ml凍存液重懸細胞,並均勻分裝到凍存管中

采用非程序降溫法,將凍存管直接放入-80℃冰箱中,凍存24h後轉移至液氮中長期保存。

2、解凍

预先包被細胞培養板,人ES和iPS细胞解冻后应立即接种到培养板中。

(1)干細胞培養基室温平衡15-30min,不能37℃加热;

(2)在水浴鍋中持續晃動凍存管,37℃水浴鍋中快速解凍細胞,直至細胞完全融化;

(3)取出凍存管,用70%乙醇擦拭凍存管表面;

(4)准备15ml离心管,预先加入5mL干細胞培養基,将细胞悬浮液缓慢逐滴至15mL离心管中,尽量保持细胞聚团状态。

(5)在室溫300×g離心5分鍾。

(6)吸掉上清,注意不要干扰细胞沉淀。使用1mL多能干細胞培養基轻轻地重悬细胞3-5次,不要破坏细胞聚团状态。

(7)分别取0.5mL细胞悬液,均匀接种到包被好的6孔板的2个孔中,并分别补充多能干細胞培養基至2m。

(8)置于37°C細胞培養箱中。在前后左右呈十字形摇动培养板板5次,以均匀分散细胞。

(9)每天更換培養基,並顯微鏡下觀察細胞狀。

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